产品特定：SimpleChIP® Plus 酶促染色质免疫沉淀试剂盒（磁珠）#9005。
必需试剂试剂包括：
甘氨酸溶液 (10X) #7005Buffer A (4X) #7006Buffer B (4X) #7007ChIP 缓冲液 (10X) #7008ChIP 洗脱缓冲液 (2X) #70095 M NaCl #70100.5 M EDTA # 7011ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006DNA Binding Buffer #10007DNA Wash Buffer（使用前加入 4 倍体积的乙醇）#10008DNA Elution Buffer #10009DNA Purification Columns #10010Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012RNAse A (10 mg/ml) #7013Micrococcal Nuclease （2000 凝胶单位/µl）#10011Proteinase K (20 mg/ml) #10012SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620Normal兔 IgG #2729DTT（二硫硫reitol) #7016不包括试剂
磁力分离架 #7017 / 14654磷酸盐缓冲盐水 (PBS-1X) pH7.2（无菌） #9872无核酸酶水 #12931乙醇 (96-100%) 甲醛 ( 37% 原液）Taq DNA 聚合酶 NTP MixI。组织交联和样品制备采集组织时，从样品中去除不需要的物质，例如脂肪和坏死物质。然后可以立即对组织进行处理和交联，或在干冰上冷冻以备后用。为获得最佳染色质产量和 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。染色质产量确实因组织类型而异，有些组织每次免疫沉淀可能需要超过 25 mg。有关不同类型组织的预期染色质产量的更多信息，请参阅附录 A。应处理一份额外的染色质样品用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。
开始之前：移除和战争m 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 和 10X 甘氨酸溶液。确保 PIC 完全解冻。每 25 mg 待处理组织准备 3 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC 并置于冰上。每 25 mg 待处理组织准备 45 µl 37% 甲醛并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。交联称重新鲜或冷冻的组织样本。每个要执行的 IP 使用 25 毫克的组织。将组织样本放入 60 毫米或 100 毫米的盘子中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。将切碎的组织转移到 15 ml 锥形管中。向锥形管中每 25 mg 组织添加 1 ml PBS + PIC。要将蛋白质交联到 DNA，添加 45 µl 37每 1 ml PBS + PIC 的甲醛百分比，并在室温下摇晃 20 分钟。最终甲醛浓度为 1.5%。通过添加 10 停止交联每 1 ml PBS + PIC 加入 0 µl 10X 甘氨酸，并在室温下混合 5 分钟。在 4°C 的台式离心机中以 1,500 rpm 的转速离心组织 5 分钟。去除上清液并用 1 ml PBS + PIC 洗涤一次每 25 mg 组织。在台式离心机中在 4°C 下以 1,500 rpm 重复离心 5 分钟。去除上清液，每 25 mg 组织在 1 ml PBS + PIC 中重悬组织并储存在冰上。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分）将组织分解成单细胞悬浮液。B.使用 BD Biosciences 的 Medimachine 进行组织分解（部件号 340587）切掉 1000 µL 移液器尖端的末端以扩大用于转移组织块的开口。将重悬于 PBS + PIC 中的 1 ml 组织转移到 50 mm 的顶部腔室中medicone（部件号 340592）。根据制造商的说明研磨组织 2 分钟。使用 1 ml 注射器和 18 号钝针从 medicone 的底部室收集细胞悬浮液。转移细胞悬液n 到 15 ml 锥形管中并置于冰上。重复步骤 2 至 4，直到所有组织都处理成均匀的悬浮液。如果需要更多研磨，请向组织中添加更多 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到所有组织都被研磨成均匀的悬浮液。通过显微镜（可选）检查单细胞悬浮液。在台式离心机中于 4°C 下以 1,500 rpm 的速度离心细胞 5 分钟。从细胞中去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。C。使用 Dounce 匀浆器进行组织分解将重新悬浮在 PBS + PIC 中的组织转移到 Dounce 匀浆器中。用 20-25 次冲程分解组织块。通过显微镜检查单细胞悬浮液（可选）。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中，并在台式离心机中以 1,500 rpm 的转速在 4°C 下离心 5 分钟。从细胞中去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第三部分）.II.细胞培养交叉连接和样品制备为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 4 X 106 个细胞。对于 HeLa 细胞，这相当于 15 cm 培养皿的一半，其中含有在 20 ml 生长培养基中 90% 汇合的细胞。应处理一个额外的样本用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。在实验中加入一盘额外的细胞，用于使用血细胞计数器测定细胞数量。
开始前取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012 和 10X 甘氨酸溶液 #7005。确保 PIC 完全解冻。准备 2 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 10 µl 200X PIC 每 15 cm 待处理的培养皿并置于冰上。每 15 cm 培养皿准备 40 ml PBS 待处理并置于冰上。准备 540 µl 37%每 15 cm 培养皿中的甲醛要处理并保持在室温下。使用未通过制造商检测的新鲜甲醛过期日期。要将蛋白质与 DNA 交联，请向每个含有 20 毫升培养基的 15 厘米培养皿中加入 540 微升 37% 甲醛。短暂旋转以混合并在室温下孵育 10 分钟。最终甲醛浓度为 1%。添加甲醛可能会导致培养基颜色发生变化。将 2 ml 10X 甘氨酸添加到每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中，短暂旋转以混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能会导致培养基颜色发生变化。对于悬浮细胞，将细胞转移到 50 ml 锥形管中，在台式离心机中 4°C 下以 1,500 rpm 离心 5 分钟，然后用 20 ml 冰洗涤沉淀两次冷 PBS。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。对于贴壁细胞，去除培养基并用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次完全去除培养皿中的洗涤液。加入 2 ml 冰-冷 PBS + PIC 到每个 15 厘米的培养皿中。将细胞刮入冷缓冲液中。将所有培养皿中的细胞合并到一个 15 ml 锥形管中。在 4°C 的台式离心机中以 1,500 rpm 的转速离心细胞 5 分钟。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。细胞核制备和染色质消化一次免疫沉淀制备（IP 制备）定义为 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞。
开始前取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保在使用前完全解冻。准备 1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O）。确保 DTT 晶体完全溶解。
重要提示：一旦溶解，将 1M DTT 储存在 -20°C。
取出并加热 10X ChIP Buffer #7008，确保 SDS 完全溶解.准备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 µl 4X 缓冲液 A #7006 + 750 µl 水）+ 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC 每次 IP 制备并置于冰上。准备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 µl 4X Buffer B #7007 + 825 µl 水）+ 0.55 µl 1M DTT 每次 IP 准备并置于冰上。准备 100 µl 1X ChIP 缓冲液（10 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 90 µl 水）+ 0.5 µl 200X PIC 每次 IP 准备和置于冰上。每次 IP 制备时，将细胞重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟通过倒置管混合。在 4°C 的台式离心机中以 3,000 rpm 离心 5 分钟以沉淀细胞核。每次 IP 制备时，去除上清液并在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。重复离心，去除上清液，并在每次 IP 制备时在 100 µl 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。将样品转移到 1.5 ml 微量离心管中，每管总量不超过 1 ml。每次 IP 制备添加 0.5 µl Micrococcal Nuclease #10011，倒置管数次混合，并在 37°C 下孵育 20 分钟，并频繁混合以消化 DNA到大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟颠倒混合一次。微球菌核量将 DNA 消化至最佳长度所需的酶可能需要根据个体组织和细胞系的经验确定（参见附录 B）。每 4 x 106 个细胞用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的 HeLa 细胞核和每 25 mg 组织用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的小鼠肝组织得到适当长度的 DNA 片段。通过每次免疫沉淀制备添加 10 µl 0.5 M EDTA #7011 来停止消化并将试管置于冰上。在 4°C 下在微量离心机中以 13,000 rpm 离心 1 分钟以沉淀细胞核，然后去除上清液。根据 IP 制备在 100 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀，并在冰上孵育 10 分钟。每个 1.5 ml 微量离心管最多可处理 500 µl 裂解物，并使用多个脉冲来破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。 HeLa 核是 c使用 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/声波仪在 3 组 20 秒脉冲后完全裂解，设置为 6，探头为 1/8 英寸。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不完全。通过在 4°C 下在微量离心机中以 10,000 rpm 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新管中。这是交联染色质制剂，应在 -80°C 下保存直至进一步使用。取出 50 µl 染色质制备物，用于分析染色质消化和浓度（第 IV 部分）。染色质消化和浓缩分析（推荐步骤）向 50 µl 染色质样品（来自第 III 部分中的步骤 9）添加 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并孵育将样品在 65°C 下处理 2 小时。按照第 VII 节中所述使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA。纯化 DNA 后，取出 10 µl 样品并通过在 1% 琼脂糖凝胶上用100 bp DNA 标记。 DNA 应被消化至大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。要确定 DNA 浓度，请将 2 µl 纯化的 DNA 转移到 98 µl 无核酸酶的水中进行 50 倍稀释并读取 OD260。以 µg/ml 为单位的 DNA 浓度为 OD260 x 2,500。理想情况下，DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。注意：为获得最佳的 ChIP 结果，染色质的大小和浓度是否合适至关重要。染色质的过度消化可能会减少 PCR 定量中的信号。染色质消化不足可能导致背景信号增加和分辨率降低。在 IP 中添加的染色质太少可能会导致 PCR 定量中的信号减弱小说。染色质消化优化方案见附录 B.
V。染色质免疫沉淀为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 µg 消化的交联染色质（如第 IV 部分中所确定）。这应该大致相当于从 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞中制备的 100 µl IP 制备物。通常，在添加抗体之前，将 100 µl 消化的染色质稀释到 400 µl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要超过 100 µl 的染色质，则交联染色质制备物无需按如下所述进行稀释。抗体可直接添加到未稀释的染色质制剂中，用于染色质复合物的免疫沉淀。
开始前取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全处于溶液。解冻消化的染色质制剂（来自第 III 部分的步骤 9）并置于冰上。准备低盐洗涤液：每次免疫沉淀 3 ml 1X ChIP 缓冲液（300 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 ml 水）。在室温下储存直至使用。准备高盐洗涤液：每次免疫沉淀 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水）+ 70 µl 5M NaCl #7010。在室温下储存直至使用。在一个试管中，准备足够的 1X ChIP 缓冲液，用于将消化的染色质稀释成所需数量的免疫沉淀：400 µl 1X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl每次免疫沉淀 200X PIC。确定免疫沉淀次数时，请记住包括阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照 Normal Rabbit IgG antibody #2729 样品。将混合物置于冰上。向准备好的 1X ChIP 缓冲液中加入相当于 100 µl（5 至 10 µg of chromatin) 消化的交联染色质制剂（来自第 III 部分的步骤 9）每次免疫沉淀。例如，对于 10 次免疫沉淀，准备一个含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 µl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 µl 200X PIC + 1 ml 消化染色质制剂的试管。取出 10 µl 稀释染色质样品并转移到微量离心管。这是您的 2% Input Sample，可在 -20°C 下保存直至进一步使用（第 VI 部分中的步骤 1）。对于每次免疫沉淀，将 500 µl 稀释的染色质转移到 1.5 ml 微量离心管中并添加免疫沉淀抗体.每个 IP 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 µl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，将 1 µl（1 µg）到 2 µl（2 µg）添加到 IP 样品中。将 IP 样品孵育 4 小时以在 4°C 下旋转过夜。注意：Cell Signaling Technology 的大多数抗体在每个免疫沉淀样品 1 到 2 微克之间发挥最佳作用。如果有多个浓度不同的样品，最好将阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。
通过轻轻涡旋重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每个 IP 反应中添加 30 µl 蛋白 G 磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 2 小时。通过将试管置于磁力分离架 #7017 中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。通过向磁珠中加入 1 ml 低盐洗涤液来清洗 G 蛋白磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次，总共进行 3 次低盐洗涤。将 1 ml 高盐洗涤液加入微珠中，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。Pe通过将试管置于磁力分离架中，在每次免疫沉淀中加入蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。立即进入第 VI.VI 节。从抗体/蛋白 G 磁珠洗脱染色质和逆转交联开始前取出 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 并在 37°C 水浴中加热，确保 SDS 在溶液中。将水浴或热混合器设置为 65°C。为每次免疫沉淀和 2% 输入样品准备 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 µl 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 + 75 µl 水）。将 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液添加到 2% 输入样品管中并备用在室温下进行第 6 步。向每个 IP 样品中添加 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液。在 65°C 下轻轻涡旋（1,200 rpm）从抗体/蛋白 G 磁珠中洗脱染色质 30 分钟。恒温器最适合此步骤。或者，洗脱可以是 p在室温下旋转，但可能不那么完整。通过将管放在磁力分离架上沉淀蛋白 G 磁珠，等待 1 至 2 分钟使溶液澄清。小心地将洗脱的染色质上清液转移到新管中。所有试管，包括来自步骤 1 的 2% 输入样品，通过添加 6 µl 5M NaCl 和 2 µl Proteinase K #10012 进行反向交联，并在 65°C 下孵育 2 小时。该孵育可以延长过夜。立即进行第七部分。或者，样品可以储存在 -20°C。但是，为避免形成沉淀，请确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前将样品加热至室温（第 VII 部分，步骤 1）。VII。使用离心柱纯化 DNA 开始之前在使用前将 24 ml 乙醇 (96-100%) 添加到 DNA Wash Buffer #10008 中。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。从 Secti 中取出每个 DNA 样本的 DNA 纯化收集管 #10010在 V 上。将 750 µl DNA Binding Buffer #10007 添加到每个 DNA 样品中并短暂涡旋。每 1 体积样品应使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。将步骤 1 中的每个样品 450 µl 转移到 DNA 离心柱中收集管。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。将步骤 1 中每个样品剩余的 450 µl 转移到收集管中的离心柱中。重复步骤 3 和 4。将 750 µl DNA Wash Buffer #10008 添加到收集管中的离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱。向每个离心柱中添加 50 µl DNA Elution Buffer #10009 并放入干净的 1.5 ml 微量离心管。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒以洗脱 DNA。移除并丢弃 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。样品可以储存在-20°C。VIII。通过 PCR 对 DNA 进行定量建议使用带过滤头的移液器吸头以最大限度地降低污染风险。试剂盒中包含的对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因 (#7014 + #7015)，可用于标准 PCR 或定量实时定量时间 PCR。如果用户对其他物种进行 ChIP，建议用户针对 DNA 设计合适的特异性引物并确定最佳 PCR 条件。建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。PCR 引物选择很关键。引物设计应严格遵守以下标准：引物长度：24 个核苷酸最佳 Tm：60°CO 最佳 GC：50% 扩增子大小：150 至 200 bp（用于标准 PCR）80 至 160 bp（用于实时定量tative PCR)Standard PCR Method 标记适当数量的 0.2 ml PCR 管以用于分析样品的数量。这些应包括 2% 输入样本、阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本，以及一个没有 DNA 的试管以控制 DNA 污染。向每个试管中加入 2 µl 适当的 DNA 样本。准备一个主反应混合物如下所述，确保为两个额外的管添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个反应管中加入 18 µl 预混液。1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 12.5 µl10X PCR 缓冲液 2.0 µl4 mM dNTP 混合物 1.0 µl5 µM RPL30 引物 2.0 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl 开始以下 PCR 反应程序： A。初始变性 95°C 5 分钟。变性 95°C 30 秒。退火 62°C 30 秒。延伸 72°C 30 秒。重复步骤 b-d 总共 34 个周期。最终延伸 72°C 5 minRemove 10 µl 的每个 PCR 产物用于通过 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳与 100 bp DNA 标记进行分析。人 RPL30 #7014 的 PCR 产物的预期大小为 161 bp，小鼠 RPL30 #7015 的预期大小为 159 bp。实时定量 PCR 方法标记与要使用的 PCR 机器型号兼容的适当数量的 PCR 管或 PCR 板。 PCR 反应应包括阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本、不含用于控制污染的 DNA 的试管，以及连续稀释的 2% 输入染色质 DNA（未稀释、1:5、1:25 , 1:125) 以创建标准曲线并确定扩增效率。将 2 µl 适当的 DNA 样本添加到 PCR 板的每个试管或孔中。如下所述制备主反应混合物。为两个额外的反应添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。1 个 PCR 反应的试剂体积（18 µl)Nuclease-free H2O 6 µl5 µM RPL30 Primers 2 µlSYBR-Green Reaction Mix 10 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.初始变性 95°C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸：60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c，共进行 40 个循环。使用实时 PCR 仪提供的软件分析定量 PCR 结果。或者，可以使用百分比输入法和下面显示的等式手动计算 IP 效率。使用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表示为总输入染色质的百分比。
输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样本 - C[T] IP 样本)
C[T] = CT = PCR反应的阈值循环
IX. NG 测序文库构建使用该试剂盒制备的免疫富集 DNA 样本可直接与 ChIP-seq 兼容。对于下游 NG 测序 DNA 文库构建，使用 DNA 文库制备方案或试剂盒组件适用于您的下游测序平台。对于 Illumina® 平台上的测序，我们推荐 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 及其相关的索引引物 Multiplex Oligos for Illumina®（单索引引物）（ChIP- seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538。
建议：
对于转录因子或辅因子 ChIP-seq , 使用至少 5 ng ChIP 富集 DNA 和适配器连接 DNA 的扩增 10 个 PCR 循环。对于总组蛋白和组蛋白修饰或输入样本，从 50 ng ChIP 富集 DNA 和适配器扩增开始-用 6 个 PCR 循环连接 DNA。对于所有目标类型的 ChIP 富集 DNA 文库构建，在不选择大小的情况下对接头连接的 DNA 进行清理。DNA 文库构建后，检查 DNA 文库是否存在接头二聚体（~140 bp) 使用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒 (Agilent Technologies, Cat# G2938-90322)，或在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上用 50-100 ng DNA 进行琼脂糖凝胶电泳。如果 DNA 文库中存在接头二聚体，则重复 PCR 扩增材料的清理。文库的质量也可以使用 qPCR 和针对已知阳性和阴性目标位点的引物组来确认。阳性引物对仍应提供与比较相同的高信号如在对 ChIP 富集的 DNA 的原始 qPCR 分析中所见，为阴性引物。在最终清理和质量检查后，准备 2-10 nM 的最终纯化文库样本以进行高通量测序。附录 A：预期染色质产量收获杂交时来自组织样本的连锁染色质，染色质的产量在不同组织类型之间可能存在显着差异。右表提供了 25 mg 组织与 4 x 106 HeLa 细胞相比的预期染色质产量范围，以及预期的 DNA 浓度，如方案第 IV 节中所确定。对于每种组织类型，分解使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器产生相似数量的染色质。但是，使用 Medimachine 从组织解聚处理的染色质通常比使用 Dounce 匀浆器解聚的组织处理的染色质具有更高的 IP 效率。强烈建议使用 Dounce 均质器来分解脑组织，因为 Medimachine 不能将脑组织充分分解成单细胞悬液。为获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 µg 消化的交联染色质；因此，有些组织每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。
组织/细胞总染色质产量预期 DNA 浓度脾脏 20-30 µg/25 mg 组织 200-300 µg/ml 肝脏 10-15 µg/25 mg 组织 100- 150 µg/ml 肾脏 8-10 µg 每 25 mg 组织 80-100 µg/ml 大脑 2-5 µg 每 25 mg 组织 20-50 µg/ml 心脏 2-5 µg 每 25 mg组织 20-50 µg/mlHeLa 每 4 x 106 个细胞 10-15 µg 100-150 µg/ml 附录 B：染色质消化的优化将交联染色质 DNA 消化成 150-900 个碱基对的最佳条件长度在很大程度上取决于微球菌核酸酶与消化中使用的组织数量或细胞数量的比例。以下是用于确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的方案。
准备交叉如第 I、II 和 III 部分所述，从 125 mg 组织或 2 X 107 个细胞（相当于 5 个 IP 制备物）中提取连接的细胞核。在第 III 部分的第 2 步后停止并按如下所述进行。转移 100 µl 细胞核制备成 5 个单独的 1.5 ml 微量离心管并置于冰上。将 3 µl 微球菌核酸酶原液添加到 27 µl 1X 缓冲液 B + DTT（酶的 1:10 稀释度）中。向步骤 2 中的 5 个管中的每一个添加 0 µl , 2.5 µl, 5 µl, 7.5 µl, 或 10 µl 稀释的 M微球菌核酸酶，通过倒置试管数次混合并在 37°C 下频繁混合孵育 20 分钟。通过添加 10 µl 0.5 M EDTA 并将试管置于冰上停止每次消化。在微量离心机中以 13,000 rpm 离心沉淀细胞核在 4°C 下 1 分钟并去除上清液。在 200 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀。在冰上孵育 10 分钟。用几个脉冲对裂解物进行超声处理以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核完全裂解，设置为设置 6，带有 1/8 英寸探头。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不完全。通过 10,000 离心澄清裂解物在 4°C 下在微量离心机中转数 10 分钟。将 50 µl 的每种超声裂解物转移到新的微量离心管中。向每份 50 µl 样品中添加 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl 和 2 µl RNAse A . 涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中加入 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样品 2 小时。从每个样品中取出 20 µl，然后通过在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来确定 DNA 片段大小。观察哪种消化条件产生的 DNA 在 150-900 个碱基对（1 至 5 个核小体）的所需范围内。使用此优化方案产生所需大小的 DNA 片段的稀释微球菌核酸酶体积相当于应添加到一种免疫沉淀制备物（25 毫克分解组织细胞或 4 X 106 组织培养物）中的微球菌核酸酶原液体积的 10 倍细胞）产生欲望d DNA片段的大小。例如，如果 5 µl 稀释的微球菌核酸酶在此方案中产生 150-900 个碱基对的 DNA 片段，则应在第 III 节中的染色质消化过程中将 0.5 µl 储备微球菌核酸酶添加到一个 IHC 制备物中。如果结果表明DNA 不在所需的大小范围内，然后重复优化方案，相应地调整每次消化中微球菌核酸酶的量。或者，可以改变消化时间以增加或减少 DNA 片段化的程度。附录 C：故障排除指南问题可能原因建议 1。消化染色质的浓度太低。添加到染色质消化中的细胞不足或细胞核在消化后未完全裂解。如果染色质制剂的 DNA 浓度接近 50 µg/ml，则向每个 IP 添加额外的染色质以提供至少 5 µg/IP 并继续执行方案。
对单独的细胞板进行计数前交联以确定准确的细胞数和/或在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核完全裂解。
2.染色质消化不足且片段太大（大于 900 bp）。细胞可能过度交联。交联时间超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。
染色质消化中添加的细胞过多或微球菌核酸酶不足。
以固定时间执行时间进程甲醛浓度。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。
在交联前对单独的细胞板进行计数以确定准确的细胞数，并参见附录 B 以优化染色质消化。
3 .染色质过度消化且片段太小（仅 150 bp 单核小体长度）。将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能会在 PCR 定量期间减弱信号，尤其是对于长度大于 150 bp 的扩增子。不是染色质消化中添加了足够的细胞或过多的微球菌核酸酶。在交联前对单独的细胞板进行计数，以确定准确的细胞数，有关染色质消化的优化，请参见附录 B。 4．输入 PCR 反应中没有产物或产物很少。没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应或条件不是最佳的。
PCR 扩增区域可能跨越无核小体区域。
没有足够的染色质添加到 IP 或染色质过度消化。
在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环数。
使用来自交联和纯化的 DNA 优化实验引物组的 PCR 条件消化的染色质。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到 150 bp 以下（参见第 VIII 节中的引物设计建议）。
为获得最佳的 ChIP 结果，每个 IP 添加 5-10 µg 染色质。参见上面问题 1 和 3 的建议。
5．阳性对照无产品ol 组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应。IP 反应中加入的染色质或抗体不足或 IP 孵育时间太短。
Protein G beads 染色质洗脱不完全。
务必添加 5- 10 µg 染色质和 10 µl 抗体用于每个 IP 反应，并与抗体一起孵育过夜，并在添加蛋白 G 珠子后再孵育 2 小时。
从蛋白 G 珠子上洗脱染色质的最佳温度为 65° C 经常搅拌以保持珠子悬浮在溶液中。
6．阴性对照兔 IgG-IP 和阳性对照组蛋白 H3-IP PCR 反应中的产物量是相等的。IP 反应中添加的染色质过多或不足。或者，IP 反应中添加了过多的抗体。
PCR 反应中添加了过多的 DNA 或扩增循环过多。
添加的染色质不超过 15 µg 和 10微升组蛋白 H3 抗体用于每个 IP 反应。将正常兔 IgG 的量减少到 1 µl per IP.
在 PCR 反应中添加较少的 DNA 或减少 PCR 循环数。在 PCR 的线性扩增阶段分析 PCR 产物非常重要。否则无法准确测定起始DNA量的差异。
7．实验抗体-IP PCR 反应中没有产物。没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应。
没有足够的抗体添加到 IP 反应。
抗体不适用于 IP。
添加将更多 DNA 加入 PCR 反应或增加扩增循环数。
通常，IP 反应中会添加 1 至 5 µg 范围内的抗体；但是，确切的量在很大程度上取决于单个抗体。
增加添加到 IP 的抗体量。查找替代抗体来源。
2011 年 12 月发布
2022 年 4 月修订
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